Por: Mª Rosa Pellitero Beltrán
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMD / BMD) son trastornos musculares ligados al cromosoma X causados por mutaciones del gen de la DMD, que codifica la proteína distrofina del subsarcolema. Sin embargo, a pesar de que la alteración genética afecta únicamente a gen, su mecanismo patogénico es bastante complejo y la cantidad de estructuras que se ven alteradas son inabarcables pues se expresa en el músculo esquelético, tejido cardíaco, vascular, intestinal liso y en el sistema nervioso.
Hasta ahora, no se ha desarrollado una terapia
capaz de lograr la recuperación completa, en cambio los avances en biología
molecular han permitido el desarrollo de diversas estrategias terapéuticas. La
terapia más apropiada se basa en la complementación o restauración de la
expresión de la distrofina, apoyándonos en la terapia génica que usa vectores
virales, la terapia de lectura completa para las mutaciones sin sentido, la
terapia de omisión de exón para recuperar el marco de lectura y la terapia de trasplante
celular, las cuales se están desarrollando activamente. Entre ellos, la terapia de omisión de exón con oligonucleótidos antisentido
puede restaurar el marco de lectura y producir la conversión de un fenotipo
grave a uno leve.
Figura 1. Modelos de animales de DMD para el desarrollo de estrategias terapéuticas específicas de mutación. Con el fin de desarrollar técnicas novedosas, se necesitan utilizar ratones u otras especies de animales con síntomas de la patología de DMD, entre los cuales se han utilizado Ratones Mdx, Ratones Mdx 52, Golden Retriever y Cavalier King Charles Spaniels.
ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS QUE ACTÚAN EN MUTACIONES DE
DMD
En los últimos veinte años, la esperanza de vida de los
pacientes con DMD ha aumentado en más de 10 años de lo que era anteriormente
gracias a los avances asociados al manejo de la función cardiopulmonar. Como
tratamiento estándar, se administran corticosteroides
que prolongan la función motora normal y permiten la rehabilitación. Sin
embargo, este tratamiento no puede detener la progresión de la DMD y su uso a
largo plazo provoca efectos secundarios debilitantes que requieren estrategias
terapéuticas alternativas. El recurso más eficaz consiste en la restauración de
la proteína carente dirigiéndose a todos los órganos que la expresan. Las estrategias para la restauración de la
proteína distrofina incluyen:
- Administración de genes de mini- o microdistrofinas mediadas por vectores
- Terapia de lectura sin sentido.
- Terapia de omisión de exón
1.
TERAPIA GENÉTICA UTILIZANDO VECTORES
Esta terapia implica la introducción de un gen de DMD de
longitud completa o funcionalmente truncado (ADNc) en el ADN de las células
musculares mediante un vector viral con el objetivo de que estas células
expresen distrofina.
Los
vectores representativos usados
comúnmente en células musculares no divisorias incluyen
vectores lentivirales,
adenovirales, virus adenoasociados (AAV) y cromosomas artificiales humanos
(HAC) (se recomienda ver vídeo 1 y vídeo 2). Todos son capaces de la expresión a largo plazo del gen
exógeno sin provocar reacciones inmunes del huésped. No obstante, pese
a que la transferencia génica viral de la DMD de longitud completa pueda
restaurar la funcionalidad, la capacidad limitada de los vectores virales
recombinantes restringen esta posibilidad. Recordemos que el gen DMD tiene 79
exones que abarcan ~2500kb en el ADN
genómico, y la capacidad de carga de los vectores lentiviral, adenoviral y AAV
es de ~ 8 kb, 8–36 kb y ~ 4.7 kb, respectivamente, prueba de la dificultad que
supone transferir el gen en su totalidad.
Pero no toda esperanza está mermada. Investigaciones datadas
del año 2017, demostraron que los vectores lentivirales pueden empaquetar y entregar insertos de un tamaño similar a la
distrofina y, por tanto, son candidatos para su transducción en mioblastos de
DMD. Desgraciadamente, los problemas de bioseguridad de estos vectores inclinan
la balanza hacia el descarte, de nuevo, de este enfoque. Se describen empalmes
aberrantes, toxicidad del transgén, inmunogenicidad de las partículas del
vector y posible transmisión vertical u horizontal por replicación de los
retrovirus competentes, entre otras complicaciones.
Afortunadamente los numerosos estudios llevados a cabo en
animales y en la clínica han generado un conocimiento considerable con respecto
a los dominios estructurales de la distrofina y han permitido el diseño
racional de mini- y microdistrofinas
altamente funcionales más susceptibles a las aplicaciones de terapia
génica. Para impartir la función de la distrofina de longitud completa,
las mini- y microdistrofinas retienen los dominios de unión a actina N-terminal, ricos en cisteína, y
C-terminal, mientras que el dominio
de la barra está truncado (figura 2).
Figura
2.
Estructura de mini- y microdistrofinas y utrofinas. La
minidistrofina es una distrofina en pacientes con DMO leve que tiene un tamaño
de ~ 6.4 kb. Sobre esta base, la región de la varilla se truncó aún más
para crear una microdistrofina (4,9 kb) que se puede incorporar en los vectores
virales. Ambas distrofinas retienen los dominios de unión a actina, ricos
en cisteína (Cys) y C-terminal de la distrofina normal de longitud completa (14
kb). Fuente: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6462977/#B97-jpm-09-00016.
Los vectores
adenovirales pueden transducir eficientemente microdistrofinas es una amplia variedad de diferentes tipos de
células y se han utilizado ampliamente en estudios preclínicos y clínicos. Los riesgos y
efectos secundarios que generaban se fueron mitigando en las sucesivas
generaciones desarrolladas, pero aún así la integración de vectores adenovirales conlleva
un riesgo de malignidad debido a su capacidad para integrarse al azar en el
genoma objetivo.
Hasta la fecha, los vectores de AAV (virus
adeno-asociados) tienen la mayor seguridad y eficiencia de transfección en las
células del músculo esquelético, con la desventaja de que solo pueden
incorporar una longitud máxima de 4.9 kb.
Ø PROCESO
DE TRANSDUCCIÓN LLEVADO A CABO POR VECTORES DE AAV
1)
Incorporación de microdistrofina
más corta (CS1) en el dominio de varilla de los vectores AAV
2)
Unión del vector AAV al receptor de la membrana muscular
3)
Incorporación de CS1 al interior de la célula muscular y
migración al núcleo.
4)
Traducción del gen en el núcleo
5)
Expresión de la microdistrofina y localización en la membrana
celular.
Por último, en referencia a los vectores HAC, tienen la
capacidad de entregar regiones genéticas extremadamente grandes a las células
huésped sin integración en su genoma, lo que evita la mutagénesis de inserción
o la inestabilidad genómica. Un vector HAC con todo el gen de
la DMD humana (DYS-HAC) se puede mantener de forma estable
en ratones y en células madre mesenquimales humanas inmortalizadas (hiMSC),
constituyendo un método prometedor para futuras terapias genéticas de DMD.
2. TERAPIA
DE LECTURA
La terapia de lectura completa restaura la
expresión de distrofina a través de estrategias que inhiben la terminación de
la traducción en mutaciones sin sentido. Por ejemplo, el antibiótico gentamicina[1]
puede omitir (es decir, leer) una mutación sin sentido in vitro. Esta terapia
es aplicable a aproximadamente el 10% de los pacientes con DMD. Sin embargo, la gentamicina puede causar
nefrotoxicidad y toxicidad del nervio auditivo, por lo que la administración a
largo y corto plazo no es aconsejable para los seres humanos.
No dispuestos a abandonar este modo de actuación,
se desarrolló un nuevo compuesto de lectura parcial: PTC124 o más conocido, Ataluren, Translarna TM [2], que al aplicarse
en ratones mdx se restauró la expresión de distrofina en los músculos esqueléticos
y cardíaco. Se trata de una nueva entidad química que induce selectivamente la
lectura ribosomal de los codones de terminación prematuros, pero no normales.
Dado su perfil terapéutico (biodisponibilidad oral, especificidad y propiedades
farmacológicas), se considera un medicamento con un amplio potencial para el
tratamiento de aquellos trastornos genéticos con
opciones terapéuticas limitadas o ninguna.
Otro tratamiento alternativo con un mecanismo similar es el antibiótico sulfato de arbekacina (NPC-14), un oligonucleótido antisentido que se
administra vía intravenosa e induce la omisión del exón de terminación,
expresándose la distrofina.
Estos tratamientos siguen el modelo de actuación más
prometedor para la DMD: la omisión de exones mediada por oligonuclótidos
antisentido que convierte el ARNm fuera de marco en ARNm dentro de marco
permitiendo la producción semifuncional de distrofina.
Se recomienda ver vídeo 3.
3.
TERAPIA DE OMISIÓN DE EXÓN
Su fundamento básico consiste en omitir un exón con una
mutación o exones cercanos a la mutación original a través de oligonucleótidos
antisentido (AOs) durante el empalme del ARNm, lo que conduce a la corrección del marco
de lectura y la restauración de la expresión de distrofina en el sarcolema
(figura 3).
Los problemas éticos involucrados en esta terapia
son menores que los asociados con la terapia génica mediada por vectores o la
terapia de trasplante de células madre. Esto se debe a que los AO están
clasificados como medicamentos, en lugar de agentes de terapia génica, por la
Administración de Drogas y Alimentos (FDA) de los EE. UU. Y agencias
representativas en la Unión Europea y Japón.
La terapia de omisión de exón puede ser útil
hasta en un 90% de los pacientes con DMD con mutaciones de deleción. Se
ha demostrado que la terapia de omisión de exón convierte el fenotipo DMD en el
fenotipo BMD. Sin embargo, el escenario es complejo debido a la diversidad
fenotípica de la DMO, que va desde asintomática hasta síntomas típicos de DMD
grave.
Para
alcanzar una estrategia terapéutica exitosa, es importante comprender los
fenotipos de las mutaciones en el marco de DMO y la estructura de la distrofina
después de la omisión de exón, en lugar de simplemente corregir el marco de
lectura mediante AOs.
Figura
3. Terapia de omisión del Exon 51 para
distrofia muscular de Duchenne (DMD). (A) DMD con una eliminación del exón
52. El exón 52 (el número de bases no es un múltiplo de 3) está ausente
del pre-ARNm, lo que resulta en una desalineación del marco de lectura después
del empalme (fuera del marco); esto conduce a un codón de parada prematura
en el siguiente exón del ARNm. Como resultado, no se produce distrofina,
lo que lleva a un fenotipo distrófico grave. (B) Terapia
de omisión del exón 51 eliminado con el exón 52. El exón 51 se omite por AO (la suma de las bases
eliminadas es un múltiplo de 3) en el pre-ARNm; posteriormente, el marco
de lectura se corrige en mRNA (en marco) y la traducción progresa
normalmente. Como resultado, se produce una distrofina truncada pero
funcional, lo que resulta en un fenotipo distrófico leve. AO,
oligonucleótido antisentido; ex, exon. Fuente:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6462977/#B97-jpm-09-00016
OLIGONUCLEÓTIDOS
ANTISENTIDO
Los oligonucleótidos antisentido son ácidos
nucleicos cortos (~ 20 bases) sintetizados químicamente que están diseñados
para hibridar con secuencias de pre-ARNm complementarias. Los oligonucleótidos
antisentido se unen a un exón-límite
intrón o potenciadores de empalme exónico (ESE) para regular un espliceosoma[3]
supresor de empalme compuesto de proteínas, snRNA y mRNA. Los oligonucleótidos
más seguros y eficientes son el 2'- O -metilfosforotioato AO
(2'OMeAO) y el PMO o morfolino.
CONCLUSIÓN
Las ínfimas posibilidades de tratamiento que en un
principio se concibieron para el complejo mecanismo patológico de la DMD, se
ampliaron gracias a los distintos enfoques que ofrece la terapia génica. Sin embargo, cada uno de ellos también
enfrenta varias dificultades.
Aunque el uso de vectores
virales permite una gran adaptación independientemente de la mutación
del gen, existe un límite en el tamaño de los genes que pueden incorporarse y,
al mismo tiempo, no se puede garantizar totalmente la seguridad. Mientras
tanto, la terapia de omisión de exón
está hecha a medida según la mutación genética; sin embargo, esto confina
el número de pacientes objetivo y además, aún han de solucionarse problemas
relacionados con la eficacia de la introducción y la mejora de los
síntomas. Para la terapia de
lectura simultánea, el número de sujetos que pueden tratarse también es
muy limitado. Asimismo, en cualquier tratamiento, el tipo y número de
órganos diana (músculo esquelético, miocardio y músculo liso y sistema
nervioso) de los pacientes con DMD son muy dispares.
Los obstáculos que se plantean no hacen sombra al progreso
realizado, ni tampoco apagan las esperanzas de que un día la distrofia sea realmente historia del pasado. Hoy por hoy,
científicos, familiares y los protagonistas de esta lucha, combaten con el
convencimiento de que la ilusión, la confianza y la perseverancia son más
fuertes de lo que inimaginablemente pueda aparentar un niño en silla de ruedas.
Los retos hacen la vida interesante, superarlos hace que
tenga sentido - Joshua J. Marine.
VÍDEOS RECOMENDADOS
1. TERAPIA GÉNICA DE VECTORES
2. VIRUS ADENO-ASOCIADOS COMO VECTORES DE TERAPIA GÉNICA
3. MARCOS DE LECTURA
4. ESPLICEOSOMA O COMPLEJO DE CORTE Y EMPALME
[1] La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido capaz de inducir la lectura translacional de los codones de parada. Se está probando actualmente para determinar su eficacia en el tratamiento de pacientes con distrofia muscular de Duchenne que tienen una mutación sin sentido en el gen de la distrofina.
Para más información:
· Malik V., Rodino-Klapac LR, Viollet L., Wall C., King W., Al-Dahhak R., Lewis S., Shilling CJ, Kota J., Serrano-Munuera C., y otros. Lectura a través de gentamicina de codones de parada en la distrofia muscular de Duchenne. Ana. Neurol. 2010; 67 : 771–780. Doi: 10.1002 / ana.22024. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20517938).
· Howard MT, camisas BH, Petros LM, Flanigan KM, Gesteland RF, Atkins JF Especificidad de secuencia de lectura de codón de parada inducida por aminoglucósidos: posibles implicaciones para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne. Ana. Neurol. 2000; 48 : 164–169. doi: 10.1002 / 1531-8249 (200008) 48: 2 <164 :: AID-ANA5> 3.0.CO; 2-B. (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/1531-8249(200008)48:2%3C164::AID-ANA5%3E3.0.CO;2-B).
[2] Ataluren: producido por PTC Therapeutics Inc., South Plainfield, NJ, EE. UU, ha recibido la aprobación condicional en la Unión Europea para el tratamiento de pacientes con DMD con mutaciones sin sentido.
[3] El espliceosoma o complejo de
corte y empalme es un complejo formado por cinco ribonucleoproteínas nucleares
pequeñas (snRNP, del inglés small nuclear ribonucleoproteins)
capaz de eliminar los intrones (secuencias
no codificantes) de los precursores del ARNm; este
proceso se denomina splicing de ARN. Se recomienda ver vídeo 4.
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